細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)含硫多肽底物以及特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP2的水解，釋放出巰基，進(jìn)而使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶2的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs以無(wú)活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶-2，又稱明膠酶A （gelatinase-A）或IV型膠原酶（type IV collagenase），其前體分子量為72kDa，激活后分子量為62和56 kDa。它在血清或細(xì)胞上清中濃度通常為10至200納克/毫升。它的作用目標(biāo)是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白-5 （laminin-5）、前體腫瘤壞死因子-α（pro-TNF-α）和神經(jīng)（蛋白）聚糖（neurocan）。基質(zhì)金屬蛋白酶-2與腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、血管形成、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有關(guān)。基于含硫多肽（thiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，在特異性抑制劑OA-Hy存在與否的條件下，受到MMP2的水解，釋放出巰基（sulfhydryl group），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2的特異活性。基質(zhì)金屬蛋白酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應(yīng)液（Reagent D）        毫升

底物液（Reagent E）             微升

陰性液（Reagent F）          微升

專性液（Reagent G）          微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent G）避免光照；有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔1分鐘，讀數(shù)15次（共15分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 樣品背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入10微升待測(cè)樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈） 

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入10微升待測(cè)樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、樣品非特異活性測(cè)定

檢測(cè)開(kāi)始前，移取10微升待測(cè)樣品（100微克總蛋白）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升專性液（Reagent G），混勻后，在37℃溫度下孵育30分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品 

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

六、計(jì)算樣品活性

（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

（二） 樣品特異活性

七、 酶標(biāo)儀測(cè)定

（一） 樣品總活性檢測(cè)

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景和樣品活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里

3． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）到所有孔里

4． 加入xx微升底物液（Reagent E）到樣品活性孔里

5． 加入xx微升陰性液（Reagent F）到樣品背景孔里

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在37℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入5微升待測(cè)樣品（50微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

（二） 樣品非特異性活性檢測(cè)

檢測(cè)開(kāi)始前，移取5微升待測(cè)樣品（50微克總蛋白）到新的1.5毫升離心管，加入5微升專性液（Reagent G），混勻后，在37℃溫度下孵育30分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品

2． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔板

6． 在37℃溫度下孵育3分鐘

7． 加入10微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

8． 輕輕搖動(dòng)96孔板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

10． 活性計(jì)算：

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（三） 樣品特異性活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（10個(gè)樣本；比色皿）和50次（25個(gè)樣本；96孔板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 專性液（Reagent G）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；有效期為3個(gè)月

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：

a) 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）－12197）

7． 建議使用比色皿測(cè)定

8． 樣品須澄清，至關(guān)重要

9． 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定

10． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘

11． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗

12． 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

13． 待測(cè)樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/10微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100微克/10微升（本公司提供  BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30031.1）

14． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

15． 如果檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2抑制劑，在加入底物液（Reagent E）前，37℃下孵育30分鐘

16． 如果檢測(cè)部分或純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶2，則可以省去非特異活性檢測(cè)步驟

17． 基質(zhì)金屬蛋白酶2酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位OA-Hy敏感性酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的含硫多肽底物

18． 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感