一、檢測(cè)原理

本試劑盒采用 ELISA 雙抗體夾心法原理。用純化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體包被微孔板，向已包被板微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本，同時(shí)加入 HRP 標(biāo)記的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)檢測(cè)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加入底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（OD 值），通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 SARS-CoV-2  Nucleoprotein 濃度。

二、試劑盒組成

三、其它實(shí)驗(yàn)材料（不提供，但可協(xié)助購(gòu)買(mǎi)）

1. 酶標(biāo)儀 (主波長(zhǎng) 450nm，參考波長(zhǎng) 630nm)

2. 高精度可調(diào)移液器（已校準(zhǔn)）及吸頭：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl。一次檢測(cè)樣本較多時(shí)，建議使用多通道移液器。

3. 自動(dòng)洗板機(jī)或洗瓶

4. 微量振蕩器

5. 雙蒸水或去離子水

6. 坐標(biāo)紙

7. 量筒

四、注意事項(xiàng)

8. 試劑盒保存在 2 - 8℃，未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，建議丟棄。不可混合使用不同來(lái)源或不同批號(hào)的試劑盒組分，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用本產(chǎn)品。

9. 濃縮洗滌液低溫取出可能會(huì)伴有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加熱助溶，不影響使用。

10. 各步加樣均應(yīng)使用移液器，并經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)，以免產(chǎn)生誤差。建議一次加樣時(shí)間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如樣本數(shù)量較多，推薦使用排槍加樣。

11. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如樣本中待測(cè)物質(zhì)含量高于試劑盒檢測(cè)上限（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣本稀釋液稀釋一定的倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)需乘以總稀釋倍數(shù)。

12. 為避免交叉污染，在加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、不同樣本、不同試劑時(shí)謹(jǐn)記及時(shí)更換吸頭，封板膠紙只限一次性使用。

13. 濃縮酶結(jié)合物及顯色底物請(qǐng)避光保存，顯色底物在添加之前，應(yīng)保持無(wú)色，請(qǐng)勿使用已變?yōu)樗{(lán)色的顯色底物。

14. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

五、樣本收集、處理及保存方法

15. 細(xì)胞上清液：將培養(yǎng)基移至離心管內(nèi)，于 4℃下，1500rpm 離心 10 分鐘，取上清進(jìn)行分裝并在 - 80℃下保存樣品，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

16. 細(xì)胞提取物：吸取培養(yǎng)基并用預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞一次，吸出 PBS，在 100 mm 培養(yǎng)板加入 0.5ml 提取緩沖液。收集細(xì)胞至經(jīng)過(guò)預(yù)冷的離心管中，短暫渦旋后在冰上孵育 15 - 30 分鐘，于 4℃下 13000rpm 離心 10 分鐘，將上清液（這里是指可溶性細(xì)胞提取物）分裝至預(yù)冷的離心管中，并于 - 80℃保存，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

提取緩沖液：100 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton X - 100、0.5% 脫氧膽酸鈉、磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物、PMSF。

17. 若樣本無(wú)法立即檢測(cè)，請(qǐng)將其按最小使用量分裝， - 20℃ — - 80℃保存，避免反復(fù)凍融。如果樣本中含有大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾去除；室溫下解凍，請(qǐng)勿于 37℃或更高的溫度加熱解凍。

18. 不能檢測(cè)含 NaN3 的樣本，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的活性。

19. 請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，將樣本做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定稀釋倍數(shù)）。

六、試劑準(zhǔn)備

20. 試劑回溫：請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前 30min 內(nèi)，將試劑盒和待測(cè)樣本置于室溫下回溫。

21. 洗滌液配制：根據(jù)濃縮洗液的濃縮倍數(shù)，用雙蒸水或去離子水進(jìn)行相應(yīng)倍數(shù)稀釋后備用。

22. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：取出試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品（25ng/ml），然后取 5 只聚丙烯試管，各加入 500μl 標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣本稀釋液（S1），按照以下濃度進(jìn)行 2 倍稀釋：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 ng/ml 進(jìn)行稀釋。25ng/ml 為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品 / 樣本稀釋液（S1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0ng/ml）。使用過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品原液（25ng/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在 - 20～ - 80℃冰箱。

23. 檢測(cè)抗體工作液：根據(jù)試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)抗體稀釋液（S2）將檢測(cè)抗體濃縮液（100×）稀釋成 1 倍應(yīng)用工作液，請(qǐng)于 30min 內(nèi)使用。

七、操作步驟

24. 加樣：根據(jù)試驗(yàn)所需用量，取出相應(yīng)抗體包被板條，分別將已配制好的標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品零點(diǎn)（S1）及待測(cè)樣本以 50μl / 孔加入實(shí)驗(yàn)孔底部，盡量不觸及孔壁，同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)孔加入檢測(cè)抗體工作液（50μl / 孔），充分混勻。

25. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 90 分鐘。

26. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。

27. 顯色：每孔加入 100μl 顯色底物，用封板膠紙封板后室溫顯色 10 - 20min。

28. 終止：每孔加終止液 50μl（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

29. 測(cè)定：用酶標(biāo)儀 450nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度（OD 值），測(cè)定應(yīng)在加終止液后 5min 以內(nèi)進(jìn)行。

八、結(jié)果判斷

30. 建議采用雙波長(zhǎng)讀數(shù)，即每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的 450nm OD 值減去 630nm OD 值，為最終數(shù)值，如果做復(fù)孔，求其平均值。

31. 使用計(jì)算機(jī)軟件以吸光度 OD 值為縱坐標(biāo) (Y)，相應(yīng)的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo) (X)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本的 SARS-CoV-2 應(yīng)稀釋倍數(shù)。

本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)

九、試劑盒性能

批內(nèi)與批間差應(yīng)小于 10%

十、檢測(cè)范圍

0.78 ng/ml - 25 ng/ml

十一、靈敏度

0.4 ng/ml

十二、常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決辦法