ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要有三種，分別是磷酸鈣-DNA 共沉淀法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo) DNA 轉(zhuǎn)染法，今天師兄就先從磷酸鈣-DNA共沉淀法講起。
磷酸鈣-DNA共沉淀法

　　核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使 DNA 附在細(xì)胞表面，這回利于細(xì)胞吞入攝取核酸，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA，僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞 DNA 整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)可以用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進(jìn)行暫時性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。該方法往往被用于貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，也是的方法。

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1. 試劑的配制

(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O； 加水至100 ml pH 7.1 過濾，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2 O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L

注意：對受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的低濃度。

2. 操作步驟

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體ATCC細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培養(yǎng)，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細(xì)胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。

(4)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70% 的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)24h或更長，使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

⑤更換濃度 800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細(xì)胞大部分死亡，這時轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦ 2 周后，對照ATCC細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。

今天就到這里，下期我會講講 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法。